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Long Non의 역할에 대한 새로운 통찰

May 07, 2024May 07, 2024

Nature Communications 14권, 기사 번호: 5086(2023) 이 기사 인용

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열대열원충(Plasmodium falciparum)의 복잡한 생활사에는 숙주 세포 침입, 전파 및 면역 회피를 허용하기 위한 조정된 유전자 발현 조절이 필요합니다. 이제 기생충의 유전자 발현에서 후생적 메커니즘이 중요한 역할을 한다는 증거가 늘어나고 있습니다. 진핵생물에서는 많은 lncRNA가 게놈 구조와 유전자 발현의 중추적인 조절자로 확인되었습니다. P. falciparum에서 lncRNA의 규제 역할을 조사하기 위해 우리는 핵 및 세포질 세포 내 위치에서 유전자 간 lncRNA 분포를 탐구합니다. 초기 RNA 발현 프로파일을 사용하여 총 1768개의 lncRNA를 식별했으며 그 중 718개(~41%)가 P. falciparum의 소설입니다. 여러 추정 lncRNA의 세포내 국소화 및 단계별 발현은 RNA-FISH를 사용하여 검증됩니다. 또한 ChIRP를 사용하여 여러 후보 핵 lncRNA의 게놈 전체 점유를 탐색합니다. 결과는 lncRNA 점유 부위가 병인 및 성적 분화에 관여하는 것을 포함하여 여러 기생충 특이적 유전자 계열에 대한 특정 농축을 통해 초점적이고 서열 특이적임을 보여줍니다. 하나의 특정 lncRNA에 대한 게놈 및 표현형 분석은 성적 분화 및 재생산에 있어서 그 중요성을 입증합니다. 우리의 연구 결과는 병원성, 유전자 조절 및 성적 분화에서 lncRNA의 역할에 대한 새로운 수준의 통찰력을 제공하여 치명적인 말라리아 기생충에 대한 표적 치료 전략을 위한 새로운 길을 열었습니다.

모기 매개 전염병인 말라리아는 Plasmodium 속의 원생동물 기생충에 의해 발생합니다. 인간 감염 종 중에서 Plasmodium falciparum은 가장 널리 퍼져 있고 치명적이며 20201년에 약 627,000명이 사망했습니다. 기생충은 인간과 모기 숙주 모두에서 여러 생물학적 단계를 포함하는 복잡한 생활사를 가지고 있습니다. 포자소체는 Plasmodium에 감염된 모기에서 인간의 혈류로 전염되면서 간으로 이동하여 간세포를 침범하고 기생충 증폭을 시작합니다. 7~10일 동안 지속될 수 있는 이 적혈구 전 주기 후에 수만 개의 감염성 메로조이트가 혈류로 방출되어 적혈구를 침범합니다. 적혈구 내에서 기생충은 고리에서 영양체 및 다핵 분열 단계로 성숙합니다. 48시간 후, 새로 형성된 메로조이트가 적혈구에서 터져나와 새로운 적혈구를 재감염시켰습니다. 이 파열은 대개 임상 증상과 관련이 있습니다. 이 적혈구 내 발달 주기 동안 기생충의 일부가 남성과 여성의 배우자 세포로 분화할 수 있습니다. 암컷 Anopheles 모기가 혈액 식사 중에 섭취하면 이 게임토사이트는 모기의 장 내에서 유성 복제를 거쳐 이동성 오키네테와 난모낭으로 분화할 수 있는 접합체를 형성합니다. 난모낭은 자라서 모기의 타액선으로 이동하여 후속 혈액 식사 중에 새로운 인간 숙주를 감염시킬 준비가 된 수천 개의 새로운 포자소체를 생성합니다. 이러한 다단계 발달 생활주기는 변경된 환경 조건에 반응하여 뚜렷한 형태학적 및 생리학적 변화를 일으키며 유전자 발현의 조화된 변화에 의해 엄격하게 조절됩니다.

대량 RNA-seq 실험2,4,5,6,7, 초기 RNA 발현 프로파일8 및 단일 세포 시퀀싱9을 포함한 유전자 발현 프로파일링2,3을 통해 기생충에 있는 대부분의 유전자가 일련의 유전자 발현에서 전사된다는 사실이 밝혀졌습니다. 기생충 수명주기 전반에 걸쳐 이러한 현상을 조절하는 정확한 분자 메커니즘은 거의 알려져 있지 않습니다.

유사한 게놈 크기를 가진 다른 진핵생물과 비교하여 P. falciparum은 AT가 매우 풍부한 게놈과 상대적으로 낮은 수의 서열 특이적 전사 인자(TF)를 가지고 있는데, 이는 게놈 크기를 기준으로 예상되는 TF의 약 2/3입니다. . 기생충 게놈에서 27개의 apicomplexan apetala2(ApiAP2) DNA 결합 단백질만이 특정 TF로 확인되었습니다. 이러한 ApiAP2는 Apicomplexa10에 고유하며 전사의 활성자 또는 억제자로서 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었습니다11. 이러한 TF의 조절과 다양한 TF가 함께 작용하여 전사 네트워크를 구성하는 방법에 대한 우리의 이해는 여전히 제한적이지만 관찰된 유전자 발현 패턴은 전사9,12,13,14와 전사 후의 결합의 결과일 가능성이 높습니다. 규제 이벤트15,16,17,18. 또한 후성유전학적 연구19,20,21,22,23,24,25 및 염색체 형태 포획 방법(Hi-C)26,27,28을 통해 P. 의 염색질 상태와 3차원(3D) 게놈 구조가 제안되었습니다. falciparum은 유전자 계열의 전사 활성과 밀접하게 연관되어 있습니다. 기계 학습 알고리즘은 또한 ApiAP2 TF가 실제로 후생적 요인과 함께 작동할 수 있다고 제안했습니다. 그러나 모든 전사 조절 인자가 DNA 결합 모티프에 어떻게 모집되는지와 염색질 영역은 아직 밝혀지지 않았습니다. 새로운 치료 표적을 식별하려면 기생충 복제 수명주기를 조절하는 정확한 메커니즘을 이해하는 것이 필수적입니다.

2500 lncRNA candidates, including 1300 circular lncRNAs51,52,53,55,56. These initial studies confirmed that parasite lncRNAs are developmentally regulated but only a few of these annotated ncRNAs have been functionally characterized. Some have been linked to regulation of virulence genes57,58,59,60,61,62. It has also been established that GC-rich ncRNAs serve as epigenetic regulatory elements that play a role in activating var gene transcription as well as several other clonally variant gene families63. In addition, a family of twenty-two lncRNAs transcribed from the telomere-associated repetitive elements (TAREs) has been identified in the parasite45,47,59. These TARE-lncRNAs show functional similarities to the eukaryotic family of non-coding RNAs involved in telomere and heterochromatin maintenance64 and could have a role in regulating virulence factors. More recently, the functional characterization of two lncRNAs, gdv1-as-lncRNA and md1-lncRNA that were detected during gametocytogenesis, has revealed that sexual differentiation and sex determination in P. falciparum is at least partially regulated by lncRNAs65,66. While it is becoming evident that lncRNAs serve as an integral part of the mechanisms regulating gene expression in Plasmodium, the localization and function of most of the identified lncRNAs remain a mystery./p> or <0.5 of summed nuclear vs cytoplasmic expression level. Density plots of size (b) and GC content (c) of lncRNA candidates and annotated protein encoding mRNAs (purple). d Expression levels of primary transcripts (left), steady-state RNA (middle) of lncRNA candidates and annotated protein encoding mRNAs for Ring (R), Trophozoite (T), Schizont (S) and Late Gametocyte (LG) stages. e Relative stability of lncRNA candidates and annotated protein encoding mRNAs. The stability is based on the ratio of RNA-seq/GRO-seq transcript level. Each box represents the 25/75 percentiles, the line across the box represents the median, and the whiskers represent maximum and minimum values. Outliers are indicated with dots./p> 500 mature gametocytes). Significance of the results was calculated using the two-way ANOVA with Holm-Šídák correction (**p < 0.01, ***p < 0.001). c Exflagellation assays were performed and the number of exflagellation centers per field (n > 10) were counted. Shown are results from two biological replicates. Bars indicate the mean. (d&e) Mosquito passage: Gametocyte cultures were fed to Anopheles stephensi mosquitoes. On day 11 post-infection, midguts were removed, and oocysts were counted (d) and on day 17 post-infection salivary glands were harvested and sporozoites were counted (e). Data are pooled from 2 biological replicates. Oocyst counts were performed with 15–25 mosquito midguts per experiment. Significance of the results was calculated using the Kruskal-Wallis test with Dunn’s post-test (****p < 0.0001). For salivary gland sporozoite counts, salivary glands from 20 mosquitoes were harvested, homogenized and sporozoites counted using a hemocytometer. Shown is the average number of salivary gland sporozoites for each of two experiments. Significance was calculated using the Chi-Squared tests (****p < 0.0001). f Volcano plots for gene expression profile between the WT and ΔlncRNA-ch14 lines by –Log10 P (y-axis) and log2 Fold change (x-axis) in asexual stage parasites (Top) and in mature gametocytes (Bottom). NS: Non-significant; FC: Fold Change. g Bar graph representations of selected Gene Ontology (GO) enrichment of downregulated genes between WT and ΔlncRNA-ch14 lines are presented by Log10 P (y-axis) in asexual mature (Left) and mature gametocyte (Right) stages. Exact p values and raw data are indicated in the Source data file./p> 0.2. Cells identified as an early/late ring or late schizont containing <50 UMI/cell and <50 genes/cell were removed due to poor quality. Cells mapped to late stages, or cells not assigned to a stage in the Malaria Cell Atlas were removed if they contained <100 UMIs/cell or <80 genes/cell. Data from days 4, 6 and 10 were integrated together using Seurat’s IntegrateData function using 2000 integration anchors and 10 significant principal components. A variance stabilizing transformation was performed on the integrated matrix to identify the 750 most highly variable coding genes, and these were used to perform a principal component (PC) analysis. Significant PCs were then used to calculate three-dimensional UMAP embeddings using only coding genes. LncRNA expression was visualized on the UMAP embedding generated from coding gene expression using the package ggplot2 to assign stage-specific expression for the lncRNA./p>