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Jan 14, 2024

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 12383(2023) 이 기사 인용

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콜라겐 I 매트릭스에 내장된 다세포 종양 회전 타원체는 생체 내 환경의 생리적 환경과 복잡성을 반영하는 고형 종양 연구를 위한 일반적인 시험관 내 시스템입니다. 콜라겐 I 환경은 생리학적으로 관련이 있고 세포 침입을 허용하지만, 이러한 하이드로겔에서 회전타원체를 연구하는 것은 주요 분석 분석 및 다양한 이미징 양식에 대한 과제를 제시합니다. 이는 다른 샘플에서 일반적으로 단면화를 통해 극복할 수 있는 3D 하이드로겔의 두께 때문이지만, 다공성 특성으로 인해 콜라겐 I 하이드로겔은 특히 세포를 포함한 하이드로겔 네트워크를 보존하는 방식으로 단면화하기가 매우 어렵습니다. 침입 패턴. 여기에서는 2성분(콜라겐 I 및 젤라틴) 매트릭스에서 침습성 회전타원체를 준비하고 저온절단하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 기술은 3차원 샘플(DISC-3D)의 시험관 내 구형 저온절단 이중 하이드로겔이라고 부르는 기술입니다. DISC-3D는 세포 고정이 필요하지 않고, 침습성 스페로이드와 그 주변의 구조를 보존하며, 이미징 문제를 제거하고, 초해상도 현미경 및 질량 분석 이미징을 포함하여 3차원 스페로이드 분석에 드물게 적용되는 기술을 사용할 수 있습니다. .

평평한 2차원(2D) 기판에서 배양된 세포에 대한 시험관 내 연구는 한 세기 넘게 사용되어 왔으며 수많은 과학적 발견에 결정적인 역할을 해왔습니다. 2D 세포 배양은 계속해서 분자 및 세포 생물학의 표준 방법이지만, 3차원(3D) 세포-세포 및 세포-환경 상호 작용을 포함하여 생체 내 시스템의 중요한 측면을 요약할 수 없다는 것이 오랫동안 인식되어 왔습니다. 이러한 상호 작용은 명시적으로 발생하고 다세포인 세포 과정을 연구하는 데 특히 중요합니다. 예를 들어 발달과 고형 종양의 성장과 진행에 있습니다.

최근에는 3D 세포 배양이 점점 더 많이 사용되고 있습니다2. 여기에서 다세포 개체는 세포주 또는 환자 조직(일반적으로 각각 회전타원체 및 오가노이드라고 함)에서 성장하거나 준비되며 생체 내 세포외 기질을 모방하는 합성 또는 천연 하이드로겔에서 배양됩니다. 3차원 세포 배양은 영양분과 산소의 구배, 다양한 증식 영역, 세포-세포 및 세포-기질 상호 작용과 같은 인간 조직의 생리학을 더 잘 복제하는 것으로 나타났으며, 이는 3D 배양을 사용하여 생물학적 질문을 연구하는 데 대한 명확한 근거를 제공합니다. 자연의 다세포3,4,5,6. 3D 하이드로겔 중에서 콜라겐 I 환경은 많은 고형 종양에 대해 특별한 생리학적 관련성을 보여줍니다. 유방암에서 높은 콜라겐 I 밀도는 질병 발병의 위험 요인으로 알려져 있으며7,8 종양 주변 콜라겐 섬유의 특정 밀도와 항문 조직은 예후와 관련이 있습니다9. 세포와 콜라겐이 풍부한 간질 미세환경 사이의 상호작용은 췌장암에서도 중요하며10,11 다양한 다른 암과도 관련되어 있습니다12. 콜라겐 I은 생화학 및 네트워크 구조가 효율적인 세포 침입을 지원하므로 3D 세포 배양을 위한 매력적인 환경이기도 합니다. 또한 생화학적 구성을 변경하지 않고도 섬유 폭, 기공 크기 및 하이드로겔 강성과 같은 물리적 특성을 쉽게 조정할 수 있는 환경이므로 이러한 특성이 세포 침습 모드 및 효율성에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다13,14,15,16 .

3D 세포 배양, 특히 콜라겐 I 하이드로겔이 높은 수준의 생리학적 관련성과 생화학의 중요성을 세포 행동에 대한 물리적 특성과 분리할 수 있는 기회를 제공한다는 것이 잘 확립되어 있음에도 불구하고 3D 세포 배양의 채택은 상대적으로 느린. 거부감은 부분적으로 그러한 환경에서 고해상도 광학 현미경 이미지를 획득하는 것과 관련된 과제에서 비롯됩니다6. 세포는 최소 수십 마이크론, 아마도 100 마이크론 이상의 거리에 걸쳐 환경적 강성을 감지하고 이에 반응합니다17. 따라서 세포가 등방성 3D 환경에서와 같이 동작하려면 딱딱한 이미징 기판 위에 위치해야 합니다. 이로 인해 세포가 일반적인 높은 개구수 대물렌즈의 작동 거리를 벗어나고, 이미징 평면 외부의 산란으로 인한 높은 배경 신호, 세포 또는 세포 주변 하이드로겔의 자동 형광이 발생할 수 있습니다. 또한 3D 환경은 샘플을 통한 소분자 또는 항체의 확산을 방해하여 약물 연구와 이러한 맥락에서 형광 라벨의 도입을 모두 방해할 수 있습니다. 3D 샘플과 관련된 문제는 높은 신호 대 잡음이 가장 중요한 초고해상도 광학 이미징, 여러 양식이 사용되는 상관 접근 방식 및 질량 분석법과 같은 비광학 접근 방식과 같은 정보가 풍부한 접근 방식에서 특히 심각할 수 있습니다. 두꺼운 샘플의 산란으로 인해 샘플 표면을 제외하고 데이터 수집이 불가능한 이미징.

0.05 (n = 12, 59, and 46 slices for 3D, DISC-3D, and DISC-3D re-stained, respectively)./p>

0.05./p> 100 μm into the gel [3D high], and (bottom) following DISC-3D preparation (4 μm slices). From left to right, the columns show images taken using widefield microscopy, confocal microscopy, Airyscan imaging, lattice SIM, and STORM in a HILO implementation. No image is presented for 3D STORM imaging in the top two rows because (3D low) filtering out-of-plane light was insufficient or (3D high) the technique could not be implemented at such depths. Scale bar = 20 μm. (b) Mean measured full width at half maximum (FWHM) of collagen fibers from each microscopy technique. Error bars show standard deviation. Expected minimum FWHM of each approach is shown via dashed horizontal lines. (c) Pore size of collagen networks determined across imaging techniques and sample preparations (see Methods for details). Error bars show standard deviation. Statistical significance, number of samples assessed, and additional information about resolution of each technique are provided in Fig. S4./p> 100 μm into the gel, referred to as 3D high, middle row), and following DISC-3D preparation and cryosectioning (bottom row). All gels investigated were subjected to the first portion of the DISC-3D protocol, the addition and gelation of gelatin. Thus, the only difference between the samples in the DISC-3D images (bottom row) and the other samples (top and middle rows) is that the DISC-3D samples were frozen, removed from the sample wells, and sectioned. First, we note that qualitatively, images of the hydrogel collected near the coverslip appear similar to images of DISC-3D samples across techniques, suggesting that hydrogel structure is not adversely affected by the DISC-3D sample preparation procedure. Generally, DISC-3D samples show enhancements in image quality for all microscopy techniques explored. Widefield microscopy, which suffers from out of plane signal for 3D samples, shows obvious gains in image quality for DISC-3D samples relative to intact 3D samples (Fig. 4a, leftmost column). Confocal microscopy, Airyscan, and SIM, while providing excellent image quality and revealing consistent fiber morphology low in the gel, also show declines in image quality at increased imaging depths (Fig. 4a). We note that imaging at such depths assures the cells interrogated do not sense the underlying stiff substrate; therefore, maximizing image quality in this region is critical for studying cell behavior in a physiologically relevant context. STORM images were poor, and fibers were difficult to discern both low and high in the 3D gels, ostensibly due to challenges filtering out of plane emission in this highly scattering sample, as such filtering is critical to identification and localization of single fluorophores. The enhancement in image quality observed for DISC-3D samples opens the door to revealing details about system microstructure that would not otherwise be accessible in traditional 3D culture contexts./p> 0.95, Fig. S4a). For most microscopy techniques explored here, we find fiber widths larger than the expected fiber thickness of 50–100 nm, consistent with the measured resolutions of these techniques (Fig. 4, Fig. S4c). Given that the true fiber width falls below measured resolutions for widefield, confocal, Airyscan, and SIM, only STORM imaging—which can only be applied to DISC-3D samples—can accurately report fiber thickness (Fig. 4b). Here, we find a fiber width of approximately 75 nm in DISC-3D samples, in good agreement with measurements by electron microscopy and atomic force microscopy46./p> 0.05. (d,e) Representative normalized mass spectra collected from invasive spheroids following the DISC-3D protocol at (d) 24 °C and (e) 350 °C demonstrating the increase in signal intensity in the ≈ 650–900 m/z regime. Number at right on each panel indicates maximum intensity peak at that temperature. (f) Representative mass spectrometry images prepared following the DISC-3D protocol outlined in Fig. S1d, showing consecutive sections of single spheroids for several signal ions. In the first serial section of each signal ion, the spheroid core is marked by a white dotted line and the invasive front is denoted by a red dotted line. Color scale from minimum to maximum intensity is shown for signal ions at right. Scale bar = 500 μm./p>

100 photons) and standard deviation of the fitted Gaussian (> 50 nm and < 250 nm) to remove noise and poor-quality fits. Noise was further reduced by using a DBSCAN-based filter to remove outlier molecules in sparsely populated regions of the imaging area (Epsilon = 50 nm, MinPts = 5). After these post-processing steps, images were drift-corrected using cross-correlation with a bin size of 5. Molecules in post-processed and drift-corrected images were visualized using the “Normalized Gaussian” rendering with a lateral uncertainty set to 10 nm./p> 0.05) is denoted by a dagger (†). A denotes statistical significance and is described in the relevant figure caption when employed./p>

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